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葡萄素的生物活性研究※

2008-07-15来源:《中外葡萄与葡萄酒》杂志作者:王琴飞,李景明,黄绵佳
摘    要: 葡萄素(Viniferin)是葡萄与葡萄酒中重要功能性成分白藜芦醇(Resveratrol)聚合后的一类天然多酚。近年来的研究发现,葡萄素和白藜芦醇一样具有抗菌、抗炎、抗癌等多种生物活性,并且其活性和稳定性都高于白藜芦醇。因而在植物抗病、人体生理药理活性领域倍受关注。本文对葡萄与葡萄酒中几种主要葡萄素的生物活性、分布和检测等方面的研究进展做简要介绍。
关键词:葡萄素;白藜芦醇;生物活性;葡萄;葡萄酒

        白藜芦醇(Resveratrol)作为葡萄与葡萄酒中一种重要的功能性成分,在抗菌、抗癌、抗氧化、预防心血管疾病等方面具有异常优越的生物活性[1-3],特别是1997 年报道具有抗癌功效后[4],更是在全球范围掀起了白藜芦醇热潮。直至今日,国内很多葡萄酒生产厂商依然将白藜芦醇作为其产品品质的一个亮点进行宣传。随着对葡萄与葡萄酒中功能因子研究的深入,相继发现了更多的功能性成分,葡萄素就是新发现的、源于白藜芦醇,而功效又高于白藜芦醇的生物活性因子。
        葡萄素(Viniferin)属于芪化物的一种,是以白藜芦醇为基本单元,通过脱氢聚合反应而合成的一系列白藜芦醇聚合体。目前,已被发现并得到深入研究的主要有白藜芦醇二聚体ε-葡萄素(ε-viniferin)和δ-葡萄素(δ-viniferin)、三聚体α-葡萄素 (α-viniferin)(图1)。



 1  葡萄素的生物活性 
        与白藜芦醇的产生机制相似,葡萄素也是在葡萄受到侵染或逆境胁迫时产生的,其本质作用是葡萄抗毒素,具有帮助植株或果实抵御逆境的生理功效;同时也与白藜芦醇一样,具有很强的人体保健功能。
 1.1  葡萄素在植物体内的抗病活性
        研究发现,葡萄叶片受到紫外诱导后,会有大量的白藜芦醇和葡萄素积累以抵抗逆境[5-6]。白藜芦醇由于具有亲水性,在植物抗逆过程中并不是一个毒性化合物[6-7],其氧化聚合产物葡萄素才是真正对葡萄霉菌孢子有毒害作用的物质,这个结论与我们前期对葡萄抗逆过程中白藜芦醇的作用的认识有一定出入。Pezet等[8]的研究显示,当葡萄感染霜霉病7h后无论是抗病性植株还是敏感性植株都有白藜芦醇合成,48h后抗性植株中积累了大量的ε-葡萄素和δ-葡萄素,而敏感性植株中,白藜芦醇代谢成了不具抗菌性的云杉新苷。其中δ-葡萄素对葡萄霉菌孢子的毒性较高,可达到ε-葡萄素的5倍,而紫檀芪(甲基化白藜芦醇)的毒性与δ-葡萄素相当。葡萄遭受不同的真菌侵染时,ε-葡萄素、δ-葡萄素、α-葡萄素等主要葡萄素的含量也不同[5,9],由此可见,不同类型的侵染造成的抗逆性也不相同。
 1.2  葡萄素的主要人体生理活性及其作用机理
        葡萄素不仅是一种重要的植物化学保护剂,而且具有更广泛的人体生理活性,如抑制癌症发生、抗氧化、预防心血管疾病、抗菌、消炎等。
        白藜芦醇的抗癌作用机制有2种解释:一种是白藜芦醇有效抑制了细胞色素P450酶的活性,这种酶的激活被认为是癌症病变的一个重要诱因。Bertrand 等[10]研究表明,ε-葡萄素对细胞色素P450酶活性的抑制效果比白藜芦醇更强,从而具有更强的抗癌生理活性。另一种理解是对引起癌病变的环氧酶的抑制作用,环氧酶诱发癌症的根由在于其氧化和自由基的破坏作用。现有的研究发现,与白藜芦醇相比,二聚体葡萄素对环氧酶的抑制效果IC50(IC50半抑制浓度,即肿瘤细胞半致死率的剂量浓度, IC50值越小,表明抗癌活性越高)分别为26μmol/L和49μmol/L[11],这种直接抗氧化、间接抗癌的作用比白藜芦醇更强。另外,也有研究发现,α-葡萄素是一种较好的前列腺素H2合成酶抑制剂[12],对蛋白激酶(PKC)也有抑制作用,其IC50为62.5μmol/L[13],这些酶的活性在不同程度上与癌症病变有着密切联系,而葡萄素对上述这些癌症相关酶活性的抑制作用,综合体现出其优越的抗癌活性。
         ε-葡萄素和 δ-葡萄素具有不同程度的抗氧化作用。ε-葡萄素在二甲基亚砜(DMSO)/O2-的极性系统(IC50=0.14mmol/L)中表现出最大的抗氧化活性,而δ-葡萄素则在O/W/LOO系统中表现出最大抗氧化活性,能够使β-胡萝卜素的漂白率被抑制82%[14]。葡萄素的上述抗氧化作用也促成了其对癌症发生、发展的抑制作用,以及在心血管疾病防治中发挥重要的功效作用[15]
        目前,关于葡萄素生理活性的研究多集中在ε-葡萄素、δ-葡萄素和α-葡萄素3种结构上,其他更高聚体的葡萄素在医药领域研究还很少,这与高聚体的葡萄素在植物体中不常见且不易分离有关,但是很多白藜芦醇的衍生物逐渐倍受关注[16]

 2  葡萄与葡萄酒中葡萄素的检测
        葡萄与葡萄酒中葡萄素的发现与检测依赖于仪器的更新。最初,Langcake仅仅是利用薄层层析(TLC)法进行初步分离后,再用高效液相色谱(HPLC)法对葡萄叶片中的多种芪化物进行定量检测,结果发现了ε-葡萄素、α-葡萄素2种物质[5]。此方法在很长一段时间里被用来定性、定量测定葡萄叶片中白藜芦醇及其衍生物。
        直到1997年,Jeandet等[17]利用固相萃取(SPE)方法对样品进行初步除杂,再采用HPLC梯度洗脱的方法对不同葡萄品种叶片的白藜芦醇衍生物进行了定性定量检测,并且第一次对紫外诱导后的葡萄叶片中白藜芦醇及其多种衍生物含量的积累变化进行了检测,其中包括ε-葡萄素。在此研究基础上,Adrian等[18]利用该方法对葡萄酒中白藜芦醇、ε-葡萄素等多种芪化物进行了定性定量检测。
        随后,Pezet等[19]利用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术,结合荧光、紫外等多种检测器进行辅助定性,对白藜芦醇等10种衍生物进行了定性定量检测,第一次对2种葡萄素(ε-葡萄素,δ-葡萄素)的顺反异构体进行了定性。利用该方法,育种学家对受不同真菌侵染后的多个葡萄品种的葡萄素进行了定量测定,选育和划分了不同抗病性的葡萄品种[8,20]。在此基础上,Jean-Denis等[21]利用液相色谱-大气压光离子质谱(LC-APPI-MS)法发现了受霜霉菌侵染的葡萄叶片中除ε-葡萄素、δ-葡萄素和α-葡萄素之外,还有3种II-A类白藜芦醇聚合体。
        本实验室采用最常用的HPLC技术,建立了一种同时检测葡萄中白藜芦醇、2种二聚体葡萄素以及紫檀芪和云杉苷(白藜芦醇糖苷)等5种芪化物的检测方法(有关论文待发表),并运用到葡萄植株以及果实紫外诱导芪化物合成研究中,证明该方法稳定、可靠。

 3  葡萄素的含量测定
        在植物体内,不同种类的真菌可能诱导出不同结构和类型的聚合体,其生物活性也有所不同[5]。一般在植物叶片中,受紫外、真菌等逆境侵染都会产生葡萄素,其含量各不相同,而健康的葡萄叶片中葡萄素的含量较少或低于检测限[17,19]。近年来,在葡萄叶片、果实、根、茎和葡萄酒中均分别检测到ε-葡萄素、δ-葡萄素和α-葡萄素等多种葡萄素[21-24]。
 3.1  葡萄叶片中的葡萄素含量
        Langcake最早开展了葡萄叶片中葡萄素的紫外诱导积累研究,发现紫外线促成了叶片中葡萄素(ε-葡萄素)的大量合成[25]。目前,葡萄叶片中葡萄素的研究多数集中在不同品种和不同的诱导方式上[6,8,17,26]。随着对葡萄叶片中葡萄素研究的深入,国外已綷-有研究将葡萄素含量做为选育葡萄不同抗病性的一个指标和依据。1999年,Douillet-Breuil等[26]分别对V.rupestris,V. cinerea,V. labrusca,V. vinifera 4个葡萄品种的葡萄叶片进行紫外处理,对不同处理时间的芪化物含量变化进行了测定,其中,前3个种类的ε-葡萄素含量都在200μg/gfw左右,而V. vinifera 的3个栽培品种(Mourvedre、Xarello、黑比诺)的积累高峰都在100μg/gfw左右,说明不同的葡萄品种对紫外线的敏感性不同。随后,研究人员利用霜霉菌侵染后葡萄素产生的含量差异,结合病菌密度,对40多种葡萄品种进行了5个级别的划分:ε-葡萄素大于100μmol/gfw、δ-葡萄素大于80μmol/gfw为高抗品种;ε-葡萄素在50~90μmol/gfw之间、δ-葡萄素在40~80μmol/gfw之间为抗病品种;ε-葡萄素在25~50μmol/gfw之间、δ-葡萄素在20~40μmol/gfw之间为低抗病品种;ε-葡萄素小于25μmol/gfw、δ-viniferin小于20μmol/gfw为感病品种;而病菌密度大,2种葡萄素含量又低或低于检测限的葡萄品种为极易感病品种[20]
 3.2  果实中的葡萄素含量
        目前,葡萄果实中葡萄素的研究鲜见报道。早在1994年,Calderán等[27]利用细胞悬浮培养技术,用一种刺激剂诱导葡萄未成熟的葡萄果皮细胞壁上的细胞,发现碱性的过氧化物酶B3受刺激剂诱导活性增加,能氧化白藜芦醇生成氧化产物(ROPs),但是当时并不知道这些氧化产物的结构。后来,Morales等[22]在葡萄果实的下果皮细胞中也发现了碱性的过氧化物酶B5能氧化白藜芦醇生成二聚体。
 3.3  葡萄根茎中的葡萄素含量
        葡萄根茎一直是研究人员分离葡萄素的重要器官之一[28-33]。最近报道,Rayne等[23]发现黑比诺葡萄茎中含有丰富的ε-葡萄素,达到了1.30mg/gdw,我们的试验中也发现,赤霞珠品种的葡萄根中葡萄素含量也很丰富,其中ε-葡萄素含量达到了250μg/gfw,还发现了许多未定量的白藜芦醇衍生物(有关数据尚未报道)。
 3.4  葡萄酒中的葡萄素含量
       葡萄酒中含有葡萄素的报道较少,Adrian等[18]首次在红葡萄酒中检测到了一种白藜芦醇衍生物,但当时并不知道就是ε-葡萄素。随后,Vitrac等[24]在巴西的美乐、赤霞珠等不同品种和不同酒龄的葡萄酒中检测到了反式ε-葡萄素和δ-葡萄素。不同品种、不同酒龄的葡萄酒中2种葡萄素的含量不一,最高含量分别达到3.31mg/L和22.41mg/L,其中,δ-葡萄素在赤霞珠葡萄酒中含量微量或低于检测限,而美乐葡萄酒中δ-葡萄素的含量却占了芪化物总量的20%。至于其他更高聚体的葡萄素,目前在葡萄酒中还未见报道。
        针对我国怀涿盆地产区的赤霞珠葡萄酒进行检测分析,发现国产干红葡萄酒中ε-葡萄素、δ-葡萄素的最高含量分别达到3.07mg/L和3.65mg/L的水平,且不同的果胶酶和酵母菌处理会对葡萄素产生不同的浸提效果,其中Ultrazyme Premium果胶酶和D254、796酵母对果皮中上述芪化物的浸提效果较好。

 4  展望及研究热点
        葡萄素之所以在葡萄与葡萄酒领域中逐渐为人们所关注,主要得益于它在植物抗病、育种领域中潜在的应用价值,以及在人体生理活性、医药等方面存在的潜力。
        目前,国际上葡萄素的研究是继葡萄酒中白藜芦醇研究之后的一个最大的关注热点。随着新的分离方法、检测技术和新的药理模型的不断发展、更新,将会有更多的葡萄芪化物被发现、利用。同时芪化物研究也逐步扩大到葡萄以外的多种植物中寻找更大、更具有开发潜力的植物资源。我国拥有丰富的植物资源,这将为多途径寻找并开发利用葡萄素这种功能性成分提供巨大的可能和机会。

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